Alumna investigadora: Silvia Pintado Martín

Centro: Departamento de Química

Profesora/tutora: María del Sol Vega Alegre

Tareas realizadas:

Se ha investigado el potencial de las técnicas espectroscópicas (espectrofotometría UV-vis, espectrometría IR y espectrometría Raman), combinadas con técnicas quimiométricas de calibración multivariante (ajuste multivariable por mínimos cuadrados clásicos, mínimos cuadrados parciales y método de adiciones patrón generalizado) para analizar simultáneamente varios analitos en muestras complejas en las que las respuestas espectrales de los componentes son aditivas y se solapan.
Se ha experimentado con dos materiales diferentes: (1) caramelos de goma enriquecidos con las vitaminas ácido ascórbico, biotina y tocoferol, y (2) medicamentos antigripales que contienen dos o más de los componentes activos ácido ascórbico, ácido acetilsalicílico y paracetamol.
En primer lugar se prepararon, en cada caso, muestras sintéticas de calibración (patrones), en los que el rango de concentración de los analitos se eligió de forma que cubriese los valores de concentración en las muestras comerciales. Así se prepararon, en cada caso, 25 patrones conteniendo mezclas de los tres analitos en 5 niveles de concentración, de acuerdo a un diseño ortogonal (“l” niveles factorial parcial) para la combinación de dichos niveles. Además, a los patrones se les añadieron cantidades conocidas del resto de componentes de la matriz analítica: (1) glucosa, gelatina, sacarosa, colorante, aroma, acidulante… en el caso de la golosina, y (2) los excipientes más comunes presentes en medicamentos antigripales.
Patrones y muestras reales fueron medidos por espectrometrías ATR-FTIR, Raman y UV-vis y por HPLC.
En el caso de las golosinas vitaminadas los resultados no fueron satisfactorios por diversos motivos: la baja concentración de los analitos impidió su correcta cuantificación por IR y Raman; la textura gomosa dificultó la medida reproducible por esas mismas técnicas; la diferente solubilidad de las vitaminas estudiadas (hidrosolubles y liposolubles), junto con la ausencia de señal de la biotina en la región espectral UV-vis, impidieron la determinación simultánea de los tres analitos por UV-vis y HPLC-UV. En consecuencia, la investigación se centró en los preparados farmacéuticos.
Alícuotas de las muestras sintéticas y reales de medicamentos se disolvieron con una mezcla de metanol:agua 10:90 y se registraron sus espectros de absorción molecular en la región ultravioleta. Con los datos de los espectros obtenidos se realizó su análisis para obtener las concentraciones de los componentes activos de las muestras mediante calibración multivariable con ajuste por mínimos cuadrados clásicos (CLS) y mínimos cuadrados parciales (PLS). Para estudiar el efecto de la matriz analítica en la determinación de los componentes activos por UV-Vis se utilizó el método de adiciones patrón generalizado (GSAM). Este método requiere un proceso experimental diferente al explicado anteriormente, ya que los patrones de calibración se prepararon directamente en disolución a partir de una cantidad conocida y constante de la muestra problema y volúmenes crecientes de patrones puros de los analitos. El análisis de los datos obtenidos también se realizó mediante calibración multivariable con ajuste por CLS y PLS.
En el caso de la espectrometría ATR-FTIR, se registraron múltiples espectros de cada muestra y se promediaron, para compensar la variabilidad intrínseca del instrumento de medida. Los resultados del intervalo más relevante de los espectros registrados se trataron matemáticamente por el método PLS.
Los resultados de las técnicas multivariantes se compararon con los declarados por los fabricantes de las muestras comerciales de medicamentos y con los obtenidos mediante cromatografía (HPLC-UV) para evaluar su validez (veracidad y precisión).

Objetivos alcanzados:

Con respecto a la determinación de vitaminas añadidas a golosinas enriquecidas, no se consiguieron los objetivos previstos debido a varios factores que afectaron en diferente grado a las técnicas analíticas espectroscópicas disponibles: dificultad para obtener muestras sintéticas homogéneas con la misma textura que las muestras reales, baja concentración de vitaminas en las muestras, inferior a la sensibilidad de los instrumentos, diferente solubilidad de los analitos, analitos sin respuesta espectral que precisaron una preparación de muestra excesivamente compleja.
Con respecto a la determinación simultánea de componentes activos en productos antigripales, se demuestra el potencial de la combinación de las técnicas espectroscópicas y la calibración multivariante únicamente cuando los ptrones de calibración utilizados tienen la misma matriz analitica que las muestras reales a analizar. Además, se demuestra que el tratamiento matemático de los datos mediante calibración multivariable con ajuste por mínimos cuadrados parciales proporciona los mejores resultados.

Sectores de aplicación:

La aplicación de técnicas quimiométricas multivariantes al análisis de datos espectrales tiene gran aplicación, tanto en investigación como, especialmente, en control de calidad en la industria (farmacéutica, agroalimentaria, materiales,…) donde se precisan técnicas de análisis rápidas y robustas que permitan el control del proceso en tiempo real, tanto on-line como off-line. Las técnicas analíticas espectroscópicas cumplen los requisitos de rapidez, sencillez y reproducibilidad, pero carecen de la selectividad necesaria para determinar de forma exacta un analito en presencia de otros componentes de la muestra. Las técnicas estadísticas de calibración multivariante permiten la determinación simultánea de analitos que producen señales aditivas y/o en presencia de interferentes.

Metodología utilizada:

La determinación de la concentración de analitos absorbentes en muestras se puede llevar a cabo mediante técnicas espectroscópicas gracias a la relación directa entre la absorbancia medida y la concentración. Debido a la aditividad de las absorbancias, para la determinación simultánea de varios componentes es necesario el tratamiento de los datos con técnicas estadísticas de calibración multivariante.
En todos los casos, la metodología consiste en realizar una etapa de calibración, en la que se obtienen los coeficientes que relacionan la absorbancia con la concentración, y una etapa de predicción, en la que se obtienen las concentraciones de las muestras reales. Los patrones de calibración se preparan mezclando las cantidades adecuadas de cada componente. A partir de las medidas de absorbancia de patrones y muestras (obtenidos por espectroscopía IR y UV-Vis) se obtienen dichos coeficientes y posteriormente la concentración de los componentes a analizar, utilizando como tratamientos matemáticos la calibración multivariante con ajuste por mínimos cuadrados clásicos y mínimos cuadrados parciales. Por último, se comparan los resultados por cromatografía, ya que es una técnica de separación que proporciona resultados exactos.